机会很快就来了，因为查理五世解除了和玛丽公主的婚约，转而迎娶了葡萄牙的伊莎贝拉的行为，让亨利八世和大为恼火。
亨利八世开始怨怪凯瑟琳王后和她的娘家，认为是因为凯瑟琳才会让他颜面尽失。
加上凯瑟琳王后迟迟没有生出男性继承人，安妮的野心开始膨胀。
安妮得到了新教派的支持，因为天主教会的腐败，在英格兰国内已经民怨四起，而安妮则承诺，如果支持她成为新王后，那么她将会让新教取代天主教成为英格兰国教。
安妮开始怂恿亨利八世离婚。
由于对安妮的迷恋和对男性继承人的渴望，亨利八世于1527年与大臣向梵蒂冈递交了他与凯瑟琳王后的婚姻无效申请。
亨利八世此举惊叹欧洲，人们不愿意相信亨利八世会放弃凯瑟琳王后身后强大的娘家支持，但亨利八世却安妮的迷恋和对男性继承人的渴望，让他坚持那么做。他相信年轻貌美的安妮一定能替他生个儿子。
1528年，红衣主教坎佩乔抵达英国参加亨利八世的离婚案件审核，但听证会直到次年1月仍未举行，安妮·博林怀疑沃尔西背叛，所以教会故意拖延离婚程序。博林送给侍女·盖恩斯福特的禁书《基督教徒的顺从及基督教执政者如何治理国家》被发现，安妮·博林在沃尔西告密前向亨利八世献上了此书，亨利八世满意于书中所述君王权利大于教会的表述。
1529年5月，亨利八世与凯瑟琳的离婚审判于黑衣修道院开始，安妮·博林被送回赫弗城堡，这次的离婚审判沃尔西依旧没能帮助亨利八世胜诉，11月，沃尔西被剥夺公民身份和财产权，并于次年死去。沃尔西死后，克伦威尔被招进王宫并于次年升任枢密会重要成员，安妮·博林则搬进了沃尔西在约克广场的旧居，神学家们被纷纷说服同意离婚案。
1536年1月，前任王后凯瑟琳在金博尔顿去世，同天，安妮·博林再次流产，期间有天主教徒散布谣言说这是乱伦的产物，安妮·博林与亨利八世的感情宣告破裂。
1536年1月，前任王后凯瑟琳去世后，亨利八世与查理五世之间有了缓和矛盾的机会，克伦威尔认为安妮·博林的存在使得当初英格兰王室与教皇克雷芒七世决裂，并且安妮·博林致力于宗教改革的行为激怒了天主教徒，为避免内部分裂，必须牺牲安妮·博林。
1536年4月24日，亨利八世在克伦威尔递上的委任状上署名，授权大法官查尔斯·布兰登以及数名贵族对犯下叛国罪的人进行全名盘查。
在严刑拷打下，最后所有人都承认，安妮王后有不忠的行为。1536年5月2日，安妮由驳船带到伦敦塔，轻度精神崩溃。5月14日，克兰默宣布安妮与亨利的婚姻无效。5月15日，在伦敦塔里，安妮被指控通奸、乱伦和叛国罪，即使安妮敏锐的头脑和伶牙俐齿帮助她多次有力地反驳了对自己的指控，却改变不了最后的判决。博林等被控告的几名男子被处决。
5月19日，上午9点刚过，历史上最富盛名的女人之一，迎来了她悲惨的结局。安妮是因为通奸、乱伦、叛国、制造假币、精神疾病、企图毒死凯瑟琳王后和玛丽公主等18项罪名，被判决斩首。亨利八世从法国请来一位有名的刽子手，让他用一柄极其锋利的长剑，以一种相对优雅的手段，砍下了安妮的脑袋，被斩下的首级甚至还公开展示了一段时间。之后安妮被草草埋葬，才两岁八个月的伊丽莎白成为私生女，被赶出王宫。
国会没有通过让安妮以合适的棺材埋葬，安妮的头与身体被放入一个柜子，埋在伦敦塔的教堂中。安妮的冤情即使在她的女儿伊丽莎白时代也从未被平反，甚至连一块墓碑也没有，直到在维多利亚女王时代翻修时，才被发现确认，覆上一个大理石墓碑。
安妮被处死后第二天，亨利八世随即与安妮生前的侍从女官珍·西摩订婚。式举行婚礼，珍·西摩成为新王后（珍又称简，来自西摩家族，天主教信仰）。